Microoscopio

EL MICROSCOPIO

El microscopio (del griego μικρός micrós, ‘pequeño’, y σκοπέω scopéo, ‘mirar’) es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeños para ser observados a simple vista. El tipo más común y el primero que se inventó es el microscopio óptico. Se trata de un instrumento óptico que contiene dos o más lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refracción. La ciencia que investiga los objetos pequeños utilizando este instrumento se llama microscopía.

Dos principios están involucrados en el uso del microscopio: la magnificación (capacidad de aumentar el tamaño de una imagen) y la resolución (capacidad de producir una imagen nítida, o la capacidad del instrumento para dar imágenes bien definidas de puntos situados muy cerca uno del otro). Existen distintos tipos de microscopios, cada uno con un propósito particular, ya que cada técnica de microscopía permite observar estructuras dentro de cierto rango de tamaño, dependiendo del límite de resolución del microscopio empleado, es decir, la separación mínima que permite que dos objetos puedan ser distinguidos como diferentes.

La gran diferencia entre ambos tipos es la “radiación” que emplean para iluminar el objeto de interés y el límite de resolución, que depende de las características físicas de la radiación empleada (luz visible o electrones). En el caso de los microscopios ópticos, la radiación utilizada es la luz visible. En los microscopios electrónicos, la radiación es un haz de electrones, posibilitando un poder de resolución de 0,1nm.

HISTORIA DEL MICROSCOPIO

Anton van Leeuwenhoek

El microscopio fue inventado hacia los años 1610, por Galileo, según los italianos, o por Zacharias Janssen, en opinión de los holandeses. Pero fue el holandés Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723) nacido en Delf, el que popularizó el uso del instrumento para la observación de seres vivos.

Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723), fabricante holandés de microscopios, pionero en descubrimientos sobre los protozoos, los glóbulos rojos de la sangre, el sistema de capilares y los ciclos vitales de los insectos.

Nacido en Delft, Leeuwenhoek recibió escasa formación científica. Mientras trabajaba como comerciante y ayudante de cámara de los alguaciles de Delft, construyó como entretenimiento diminutas lentes biconvexas montadas sobre platinas de latón, que se sostenían muy cerca del ojo. A través de ellos podía observar objetos, que montaba sobre la cabeza de un alfiler, ampliándolos hasta trescientas veces (potencia que excedía con mucho la de los primeros microscopios de lentes múltiples).

Robert Hooke

EL DESCUBRIMIENTO DE LA CÉLULA 

Robert Hooke, nacido el 18 de julio de 1635 en Freshwater, Inglaterra, murió el 3 de marzo de 1702, en Londres. En 1665, Robert Hooke, al observar al microscopio, muy rudimentario en aquella época, un fragmento decorcho descubre que está compuesto por una serie de estructuras parecidas a las celdas de los panales de las abejas, por lo que las llamó células.

Tipos de Microoscopios

Microscopio Óptico

El tipo de microscopio más utilizado es el microscopio óptico, que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. El microscopio óptico más simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general, se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios ópticos pueden aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces.

Microfotografía de hueso

El microscopio óptico tiene un limite resolución de cerca de 200 nm (0.2 µm). Este limite se debe a la longitud de onda de la luz (0.4-0.7 µm). Las células observadas bajo el microscopio óptico pueden estar vivas o fijadas y teñidas

 Partes del microscopio óptico

Las partes del microscopio óptico son comunes y comparten los mismos componentes básicos. Los microscopios más modernos pueden tener muchas más características, incluyendo la iluminación de la transmisión/de la reflexión, los filtros, el aparato de contraste de la fase o de interferencia diferenciada o cámaras digitales.

• LENTE OCULAR: La lente está situada cerca del ojo del observador. Capta y amplía la imagen formada en los objetivos, por lo que amplia la imagen que ha sido previamente aumentada mediante el objetivo. Es la lente por la que el usuario mira a través para ver el espécimen. El ocular generalmente contiene una lente de potencia de 10 x o 15. El ocular se inserta en el extremo superior del tubo del cuerpo. Los oculares son intercambiables y muchos diversos oculares se pueden insertar con diversas magnificaciones. Es a través del ocular que el usuario observa la muestra. En función del número de oculares se puede distinguir entre microscopios monoculares, binoculares e incluso trinoculares. La combinación de objetivo y ocular determina el aumento total del microscopio.

• LENTE OBJETIVO: El objetivo es el conjunto de lentes que se encuentran más cerca de la muestra y que producen la primera etapa de aumento. Esta lente está situada en el revólver, suele tener una distancia focal muy corta. Amplía la imagen, es un elemento vital que permite ver a través de los oculares. Es una de las partes más importantes de un microscopio compuesto, ya que son las lentes más cercanas a la muestra. Algunos objetivos de alto rendimiento pueden requerir que los oculares emparejados ofrezcan el mejor rendimiento óptico.El aumento del objetivo junto con su apertura numérica suele estar estar escrito en su parte lateral.

• BRAZO: Es la estructura que sujeta el tubo, la platina y los tornillos de enfoque asociados al tubo o a la platina, lo que se constituye como el esqueleto del microscopio. La unión con la base puede ser articulada o fija. Principalmente conecta la superficie donde se coloca la muestra con el ocular por donde ésta se puede observar. El brazo conecta el tubo del cuerpo a la base del microscopio. 

• TUBO: El tubo es una pieza estructural unida al brazo del telescopio que conecta el ocular con los objetivos. Es un elemento esencial para mantener una correcta alineación entre los elementos ópticos.  El tubo óptico se puede acercar o alejar de la preparación (lo que se quiere ver) mediante un TORNILLO MACROMÉTRICO o de grandes movimientos que sirve para realizar un primer enfoque. El tornillo macrométrico permite hacer un movimiento rápido hacia arriba o hacia abajo del tubo o la platina, y se utiliza para localizar la imagen a observar.

• REVÓLVER: El revólver es una pieza giratoria donde se montan los objetivos. Cada objetivo tiene proporciona un aumento distinto, el revólver permite seleccionar el más adecuado a cada aplicación. Habitualmente el revólver permite escoger entre tres o cuatro objetivos distintos. Permite girar, cambiar los objetivos. La esfera se suele llamar CABEZAL y contiene los sistemas de lentes oculares (monoculares o binoculares (2 lentes)).

• PLATINA: Esta es la superfície donde se coloca la muestra que se quiere observar. Su posición vertical con respecto a las lentes del objetivo se puede regular mediante dos tornillos para generar una imagen enfocada. La platina tiene un agujero en el centro a través del cual se ilumina la muestra. Generalmente hay dos pinzas unidas a la platina que permiten mantener la muestra en posición fija.

• ESPEJO:  Sobre la PLATINA se coloca la preparación que se va a observar con un Orificio central por el que pasa la Luz procedente del Espejo. El ESPEJO con una cara plana y otra cóncava, está montado sobre un eje giratorio ubicado en la zona más inferior del brazo por debajo de la Platina.

• PINZAS DE SUJECIÓN: Parte mecánica que sirve para sujetar la preparación. La mayoría de los microscopios modernos tienen las pinzas adosadas a un carro con dos tornillos, que permiten un avance longitudinal y transversal de la preparación.

• CONDENSADOR: El condensador es el elemento encargado de concentrar los rayos de luz provenientes del foco a la muestra. En general, los rayos de luz provenientes del foco son divergentes. El condensador consiste en un seguido de lentes que cambian la dirección de estos rayos de modo que pasen a ser paralelos o incluso convergentes.

• DIAFRAGMA: es un pieza que permite regular la cantidad de luz incidente a la muestra. Normalmente se encuentra situado justo debajo la platina. Regulando la luz incidente es posible variar el contraste con el que se observa la muestra. El punto óptimo del diafragma depende del tipo de muestra observada y de su transparencia.

• FOCO O FUENTE DE LUZ: Este es un elemento esencial que genera un haz de luz dirigido hacia la muestra. En algunos casos el haz de luz es primero dirigido hacia un espejo que a su vez lo desvía hacia la muestra. La posición del foco en el microscopio depende de si se trata de un microscopio de luz transmitida o de luz reflejada.

• Tornillo MACROMÉTRICO: Este tornillo permite ajustar la posición vertical de la muestra respecto el objetivo de forma rápida. Se utiliza para obtener un primer enfoque que es ajustado posteriormente mediante el tornillo micrométrico.

• TORNILLO MICROMÉTRICO: El tornillo micrométrico se utiliza para conseguir un enfoque más preciso de la muestra. Mediante este tornillo se ajusta de forma lenta y con gran precisión el desplazamiento vertical de la platina.

• BASE: Es la pieza que se encuentra en la parte inferior del microscopio y sobre la cual se montan el resto de elementos. Acostumbra a ser la parte más pesante para proporcionar suficiente equilibrio y estabilidad al microscopio. Es habitual que incluya algunos topes de goma para evitar que el microscopio se deslice sobre la superficie donde se encuentra.

Funcionamiento

El principio de funcionamiento de un microscopio óptico se basa en la propiedad de algunos materiales que permiten cambiar la dirección de los rayos de luz. Esto permite fabricar lentes capaces de hacer converger o divergir los rayos de luz. Mediante la combinación de estas lentes se puede generar una imagen aumentada de cualquier objeto. Este microscopio combina al menos dos juegos de lentes, el objetivo y el ocular. Por detrás de la muestra hay una lámpara cuya luz atraviesa la muestra y forma una imagen en el objetivo que es ampliada y proyectada hacia el ocular. El funcionamiento del objetivo podría asimilarse al funcionamiento de la lente de un proyector de cine y la forma en la que se proyecta la imagen sobre la pantalla.

La imagen que proyecta el objetivo se forma en el aire entre el objetivo y el ocular. Esta imagen se conoce como imagen primaria o imagen aérea. Esta imagen primaria alcanza el siguiente juego de lentes, el ocular, que actúa como una lupa ampliando la imagen primaria.

La imagen ampliada por el ocular, llamada imagen secundaria, alcanza finalmente la retina y es la que ve el observador. Esta imagen se suele conocer con el nombre de “imagen virtual” ya que es percibida por el observador como si estuviese situada en un plano más allá del objeto real observado (en el esquema superior está identificado con el nombre de “imagen virtual”). Los rayos de luz que percibe el ojo y que forman la imagen final parecen provenir de este plano pero realmente el objeto no está ahí. En el esquema puedes ver que los rayos reales, representados con líneas continuas, y los rayos virtuales, representados con líneas discontinuas, coinciden en su trayectoria cuándo entran al ojo y por eso los rayos de luz virtuales se consideran extensiones de los reales.

En el funcionamiento del microscopio óptico se producen dos ampliaciones de la imagen, una en el objetivo y otra en el ocular, llamadas ampliación primaria y ampliación secundaria respectivamente. La multiplicación de ambas ampliaciones da el poder de aumento total del microscopio. El objetivo siempre produce un aumento mucho mayor que el ocular. Además, el ocular suele ser fijo y los objetivos intercambiables para conseguir diferentes aumentos según la necesidad. Por ejemplo, un ocular estándar suele tener 10x aumentos, si se combina con un objetivo de 40x, se obtendrá un aumento total de 400x.

Microscopio Electrónico

La potencia amplificadora de un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de la luz visible. El microscopio electrónico utiliza electrones para iluminar un objeto. Dado que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz, pueden mostrar estructuras mucho más pequeñas. La longitud de onda más corta de la luz visible es de alrededor de 4.000 angstroms (1 ángstrom equivale a 0,0000000001 metros). La longitud de onda de los electrones que se utilizan en los microscopios electrónicos es de alrededor de 0,5 angstroms.
Todos los microscopios electrónicos cuentan con varios elementos básicos. Disponen de un cañón de electrones que emite los electrones que chocan contra el espécimen, creando una imagen aumentada. Se utilizan lentes magnéticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios ópticos no funcionan con los electrones. El sistema de vacío es una parte relevante del microscopio electrónico. Los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, de forma que tiene que hacerse un vacío casi total en el interior de un microscopio de estas características. Por último, todos los microscopios electrónicos cuentan con un sistema que registra o muestra la imagen que producen los electrones.

Hay dos tipos básicos de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de transmisión (Transmission Electron Microscope, TEM) y el microscopio electrónico de barrido (Scanning Electron Microscope, SEM). Un TEM dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada del espécimen. Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de angstroms. Se coloca una placa fotográfica o una pantalla fluorescente detrás del objeto para registrar la imagen aumentada. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces.
El microscopio electrónico de transmisión (MET) tiene un límite de resolución decerca de 2 nm. Esto es debido a limitaciones del lente usado para enfocar electrones hacia la muestra. Un MET mira a replicas de células muertas, después de haber sido fijadas y teñidas con iones de metales pesados. Los electrones son dispersados cuando pasan a través de una fina sección del espécimen, y luego detectados y proyectados hacia una imagen sobre una pantalla fluorescente.

Un microscopio electrónico de barrido crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto. No es necesario cortar el objeto en capas para observarlo, sino que puede colocarse en el microscopio con muy pocos preparativos. Explora la superficie de la imagen punto por punto, al contrario que el TEM, que examina una gran parte de la muestra cada vez. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de electrones por la pantalla de una televisión. Los electrones del haz pueden dispersarse al alcanzar la muestra o provocar la aparición de electrones secundarios. Los electrones dispersados y los secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrónico situado a los lados del espécimen. Cada punto leído de la muestra corresponde a un píxel en un monitor de televisión. Cuanto mayor sea el número de electrones contados por el dispositivo, mayor será el brillo del píxel en la pantalla. A medida que el haz de electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor. Los microscopios electrónicos de barrido pueden ampliar los objetos 100.000 veces o más. Este tipo de microscopio es muy útil porque, al contrario que los TEM o los microscopios ópticos, produce imágenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto.

• Más información en: https://www.mundomicroscopio.com/microscopio-electronico/

Funcionamiento

En el microscopio electrónico de barrido es necesario acelerar los electrones en un campo eléctrico, para aprovechar de esta manera su comportamiento ondulatorio, lo cual se lleva a cabo en la columna del microscopio, donde se aceleran por una diferencia de potencial de 1,000 a 30,000 voltios. Los electrones acelerados por un voltaje pequeño son utilizados para muestras muy sensibles, como podrían ser las muestras biológicas sin preparación adicional, o muestras muy aislantes. Los altos voltajes se utilizan para muestras metálicas, ya que éstas en general no sufren daños como las biológicas, y de esta manera se aprovecha la menor longitud de onda para tener una mejor resolución. Los electrones acelerados salen del cañón, y son enfocados por las lentes condensadora y objetiva, cuya función es reducir la imagen del filamento, de manera que incida en la muestra un haz de electrones lo más pequeño posible (para así tener una mejor resolución). Con las bobinas deflectoras se barre este fino haz de electrones sobre la muestra, punto por punto y línea por línea.

Cuando el haz incide sobre la muestra, se producen muchas interacciones entre los electrones del mismo haz, y los átomos de la muestra; puede haber por ejemplo, electrones rebotados como las bolas de billar. Por otra parte, la energía que pierden los electrones al "Chocar" contra la muestra puede hacer que otros electrones salgan despedidos (electrones secundarios), y producir rayos X, electrones Auger, etc. El más común de éstos es el que detecta electrones secundarios, y es con el que se hacen la mayoría de las imágenes de microscopios de barrido.

Podemos también adquirir la señal de Rayos X que se produce cuando se desprenden estos mismos de la muestra, y posteriormente hacer un análisis espectrográfico de la composición de la muestra .

Microscopio óptico	Microscopio electrónico
Fuente de iluminación: La luz	Fuente de iluminación: electrones
Se pueden ver seres vivos	No se pueden ver los seres vivos
Poco aumento (X1000)	Mucho aumento (X300 000)
Se observa la estructura	Se observa la ultraestructura
Preparaciones sencillas	Preparaciones complejas
Aparato relativamente barato	Instrumento muy caro